Белки теплового шока

Оглавление

1. Hsp 27

2. Hsp 60

3. Hsp 70

4. Hsp70B

5. Hsp90α

 

Сокращения раздела

АФК – активные формы кислорода

РА – ревматоидный артрит

РВВ – рецидивирующий вульвовагинит

СКВ – системная красная волчанка

Ig – иммуноглобулины

HSP – белки теплового шока

 

 

В 1974 году Тиссиерес и соавт. впервые обнаружили, что в ответ на повышение температуры среды у личинок дрозофилы происходит активация синтеза специфической группы белков. Эта группа белков получила название белков теплового шока (heat shock proteins, Hsp). Позже было установлено, что синтез Hsp индуцируется не только при повышении температуры, но и при многих других неблагоприятных воздействиях, таких как добавление к клеткам органических растворителей, тяжелых металлов, сильных оксидантов, а также под влиянием некоторых гормонов и ростовых факторов. В связи с этим некоторые авторы называют Hsp стресс-белками.

 

Белки теплового шока

 

В эволюционном отношении Hsp относятся к высококонсервативным белкам и обнаруживаются во всех организмах от бактерий до человека. Это свидетельствует о том, что они выполняют фундаментальные клеточные функции. Как цитопротекторные свойства стресс-белков, так и их роль в процессах нормальной жизнедеятельности клетки во многом определяется тем, что эти белки являются шаперонами. Шапероны – это белки, которые облегчают формирование вторичной и третичной структуры других белков. Hsp также участвуют в процессах репарации или элиминации неправильно свернутых или денатурированных белков.

Согласно современной классификации выделяют семь (в последнее время говорится даже о восьми) типов sHsp, которые разделяют либо по м.м., либо по выполняемым в клетке функциям. Различают малые Hsp (small Hsp, sHsp) с м.м. 25/27 кДа, 22 и 20 кДа, а также высокомолекулярные Hsp110, 100, 90, 70, 60, 40. По характеру синтеза Hsp (подобно NO-синтазе) подразделяются на коститутивные и индуцибельные. Конститутивные Hsp синтезируются в клетке постоянно, и для их активации не требуется воздействия на клетку повреждающего фактора, т.е. синтез их при стрессе не увеличивается.

Синтез индуцибельных Hsp начинается вскоре после воздействия на клетку повреждающего агента. Данные, полученные in vivo, свидетельстствуют о том, что разделение Hsp на конститутивные и индуцибельные в человеческом организме достаточно условно, т.к. их  синтез зависит от специализации и функциональной активности клеток. Каждый из охарактеризованных Hsp выполняет специфические функции. Так, белки семейства Hsp70 (как и их бактериальный аналог DnaK), взаимодействуют с вновь синтезируемой на рибосомах полипептидной цепью, предотвращают преждевременное неправильное сворачивание незрелой полипептидной цепи и участвуют в транспорте белка к определенным органеллам (митохондриям, эндоплазматическому ретикулуму и т.д.). Hsp100 очень близок Hsp70 и выполняет защитную функцию, предохраняя организм в условиях  стресса. Hsp90 образуют сложный комплекс с несколькими вспомогательными белками (т.н. кошаперонами). Такой комплекс взаимодействует с рецепторами стероидных гормонов, обеспечивает их эффективное связывание с рецепторами и последующий перенос гормонрецепторного комплекса в ядро. Помимо этого, Hsp90 участвуют в направленном переносе нескольких типов протеинкиназ к участкам их функционирования. Hsp60 могут участвовать в фолдинге сложно устроенных многодоменных белков (таких как актин или тубулин), а также в АТФ-зависимом исправлении ошибок в структуре частично денатурированных белков. К последней группе белков теплового шока относятся sHsp, выполняющие множество разных функций в клетке.

Известно, что накопление белковых агрегатов, являющееся результатом их неправильного сворачивания, сопровождает ряд заболеваний, таких как катаракта, цирроз печени, некоторые виды миопатий, губчатые энцефалопатии (болезнь Куру, болезнь Крейцфельда-Якоба), нейродегенеративные болезни и др. При болезни Паркинсона в клетках обнаруживаются так называемые тельца Леви, состоящие из sHsp и нейрофиламентов, а цирроз печени сопровождается накоплением телец Маллори, образованных кератиновыми филаментами и sHsp. Зачастую агрегаты неправильно свернутых белков образуют β-амилоидные структуры, которые очень устойчивы к протеолизу и не могут быть удалены из клетки. Агрегаты белков, накапливающиеся внутри клетки или в межклеточном пространстве, невыясненным пока механизмом оказывают повреждающее влияние и приводят к гибели клеток. Детальное исследование взаимодействия sHsp с белками промежуточных филаментов может дать ключ к пониманию молекулярных механизмов развития вышеперечисленных заболеваний. Повышенный синтез sHsp наблюдается не только в клетках, в которых происходит накопление нерастворимых белковых агрегатов, но и в клетках, подвергшихся воздействию различных неблагоприятных факторов.

Особое внимание уделяется проблеме неспецифического ответа клетки на повреждение, так как предполагается, что между стресс-контролем и контролем роста и дифференцировки клеток существуют тесные взаимосвязи. Hsp участвуют в формировании явления перекрестной резистентности и феномена адаптационной стабилизации структур, в восстановлении нативной конформации белковых молекул, в восстановлении активности ферментов и, наконец, они взаимодействуют с антиоксидантной системой и системой генерации оксида азота. Система Hsp является одним из обязательных звеньев неспецифического ответа клетки на повреждение, и в организме человека эта система находится под нейрогуморальным контролем. Было доказано, что Hsp опосредуют действие глюко-, минералокортикоидов и половых гормонов. В настоящее время кортикостероидам придается решающее значение в координации взаимодействия эндокринной и иммунной сис тем при стрессе. Поэтому участие отдельных Hsp в рецепции кортикостероидов и стероидогенезе может предопределять связь между внутриклеточной эндогенной системой защиты, к которой относится система Hsp и центральным звеном общего адаптационного синдрома при стрессе. Hsp, как шапероны, участвуют в синтезе гликопротеинов, к которым относится тиреоглобулин, причем механизмы стрессорной активации синтеза белков теплового шока характеризуются высокой тканевой специфичностью.

 

Предполагаемый механизм взаимодействия малых белков теплового шока с частично денатурированными белками

 

Белок теплового шока Hsp27

Hsp27 человека – это член высоко консервативного семейства белков Hsp млекопитающих. Hsp27 конститутивно экспрессируется во многих тканях и его экспрессия повышается до максимального уровня после стресса различных видов, включая повышение температуры, контакт с токсичными металлами, химическими веществами и оксидантами. Hsp27 колокализуется с актиновыми филаментами в сердечных, скелетных и гладких мышцах. Он существует в виде больших олигомеров, которые предположительно обладают шаперон-подобной активностью, и в виде меньших олигомеров, которые закрывают конец мирофиламента и стабилизируют его. Показано, что Hsp27 играет важную роль во многих клеточных функциях, таких как выживание клетки во время стресса, апоптоз и реорганизация микрофиламентов при ответе на ростовые факторы или стресс, а также в сокращении гладкой мускулатуры. В ответ на тепловой шок и другие различные стимулы, такие как цитокины, факторы роста и пептидные гормоны происходит фосфорилирование Hsp27. Фосфорилирование обусловлено активацией сигнального пути p38 MAP киназы с непосредственным участием киназа-активируемой протеин киназы-2 (MAPKAPK-2). Прямым с ледствием фосфорилирования Hsp27 является снижение олигомеризации и изменение колокализации этого белка с актиновыми филаментами.

По данным ряда авторов оксидативный стресс сопровождается усиленным синтезом sHsp. Большая часть исследователей склоняется к заключению, что sHsp защищают клетку от окислительного шока, хотя в литературе высказывается и противоположная точка зрения. Предполагают, что sHsp каким-то образом активируют или стабилизируют глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, фермент, продуктом которого является NADPH. Повышение уровня NADPH увеличивает активность глутатион-редуктазы, а это, в свою очередь, обеспечивает поддержание нормального уровня восстановленного глутатиона. В опытах, проведенных с животными, имеющими точечные мутации Hsp27, было установлено, что защитный эффект против окислительного шока проявляют только формы Hsp27, способные образовывать крупные олигомерные комплексы. Мутации, имитирующие фосфорилирование и приводящие к диссоциации крупных олигомеров, вызывают существенное уменьшение защитного эффекта Hsp27.

В зависимости от концентрации образовавшихся активных форм кислорода (АФК) окислительный стресс в конечном итоге ведет либо к некрозу, либо к апоптозу. Высокий уровень АФК вызывает сильное повреждение белков, липидов, нуклеиновых кислот, следствием чего является некроз. Умеренный окислительный стресс вызывает программируемую гибель клетки, т.е. приводит к апоптозу. Результаты одной из работ, выполненной на культуре эмбриональных фибробластов крысы, свидетельствуют о том, что Hsp27 препятствует некрозу, но не влияет на апоптоз. По мнению авторов, защитный эффект был связан с вызванной Hsp27 стабилизацией актиновых филаментов. Однако накапливается все больше данных о возможном участии sHsp в регуляции апоптоза.

В некоторых злокачественных опухолях заметно повышен уровень экспрессии Hsp27, что коррелирует с ускоренным метастазированием и неблагоприятным исходом болезни. Напротив, при обнаружении в крови онкологических больных антител к Hsp27, выживаемость была выше.

 

Белок теплового шока Hsp60

Hsp60 – это молекулярный шаперон, который участвует в фолдинге и сборке митохондриальных белков и облегчает протеолитическую деградацию неправильно свернувшихся или денатурированных белков. Hsp60 –член высоко консервативного семейства, включающего молекулярные шапероны нескольких видов, такие как Hsp60 растений (также известный как связывающий белок Рубиско), GroEL, E. coli Hsp60 и Hsp65, основной антиген микобактерий. Hsp60 строго зависит от своего кошаперона – Hsp10, который связывается с ними и регулирует его субстрат-связывающую и АТФ-азную активности. Hsp60 быстро активируется при окислительном стрессе, вирусных инфекциях, химических веществах, повышении температуры и излучении. Hsp60 кодируется ядерной ДНК и синтезируется в виде большого предшественника, содержащего N-концевую последовательность, необходимую для переноса в митохондриях, а затем расщепляющегося до зрелой формы белка на митохондриальном матриксе. Hsp60 в основном локализован в митохондриях, но были показаны изменения в его внутриклеточной локализации и экспрессия на клеточной поверхности. Hsp60 был выявлен в нормальной человеческой сыворотке, было показано нарастающее снижение уровня Hsp60 в сыворотке с возрастом. Для понимания причин такого снижения и роли Hsp60 в поддержании гомеостаза и устойчивости к условиям окружающей среды требуются дополнительные исследования.

Уровни циркулирующего Hsp60 связаны с ранней сердечно-сосудистой патологией и с физиологическим дистрессом у женщин. Кроме того, существует значительная положительная ассоциация между уровнями сывороточных Hsp60 и ФНОα. Hsp60 являются антигенными мишенями для T-клеток в атеросклеротических бляшках, в связи с чем существует прямая корреляция между уровнем растворимого белка (sHsp60) и развитием атеросклероза. Была отмечена высокая встречаемость sHsp60 и Hsp70 у женщин с рецидивирующим вульвовагинитом (рВВ) и текущим бактериальным вагинозом или вагинальным кандидозом. Это подтверждает, что разница в индукции белков теплового шока может относиться к восприимчивости к рВВ инфекциям. Кроме того, была выявлена экспрессия Hsp60 в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом, что указывает на то, что Hsp60 может высвобождаться вследствие имплантации эктопического эндометрия. Анализ кривой выживаемости 247 пациенток с эпителиальной карциномой яичника показал значительную разницу в благоприятном исходе для опухолей, экспрессирующих Hsp60 (медиана выживаемости 37 месяцев по сравнению с 28 месяцами для опухолей, не экспрессирующих Hsp60).

Количественное определение уровня Hsp60 в клетках различных типов и биологических жидкостях может добавить новую информацию о физиологической роли этого белка при широком спектре патологий и очевидно позволит выявить новые маркеры прогноза и тяжести заболевания.

 

Белок теплового шока Hsp70

У человека существует не менее 11 генов семейства Hsp70, которые кодируют группу близких белков с молекулярной массой от 66 до 78 кДа. Базовый уровень экспрессии и индуцибельность в ответ на различные факторы стресса различаются для множества членов этого семейства. Шапероны Hsp70 имеют два основных функциональных домена. Высоко консервативный NH2-концевой домен обладает АТФ-азной активностью и прочно связывается с АДФ и АТФ, а COOH-терминальный домен связывается с полипептидами. Известно, что Hsp70 предпочтительно связывается с несвернутыми или частично свернутыми белками и предотвращает их  агрегацию или неправильный фолдинг. Номенклатура различных белков семейства Hsp70 обширна и основана на клеточном распределении и индуцируемости.

Индуцибельный Hsp70 – это белок, экспрессия которого активируется при попадании клетки или организма в условия стресса. Hsp70 необходим для клеточного восстановления, выживания и обеспечения нормальных клеточных функций. Он также является молекулярным шапероном, который предотвращает агрегацию белков и восс танавливает поврежденные белки в ответ на клеточный стресс, вызванный неблагоприятными воздействиями окружающей среды, патогенами и заболеваниями. В настоящее время проводятся исс ледования с целью применения протективных возможностей Hsp70 для терапевтической целей.

Молекула Hsp70 представляет собой димер, обладает способностью формировать высокоолигомерные комплексы со многими структурами в клетке и имеет по меньшей мере 8 изоформ, набор и концентрация которых зависят от типа клетки и контролируются видом стрессорного воздействия. У людей и приматов инициация синтеза HSP при стрессе связана с активацией, по меньшей мере, трех рецепторных систем: Са-мобилизующих, β-адренорецепторов и рецепторов стероидных  гормонов. Максимальный синтез Hsp70 в клетках наблюдается через 7-8 ч после окончания теплового шока и поддерживается на высоком уровне еще 4-5 ч. Через 24 ч после шока синтез Hsp70 значительно уменьшается. Напротив, для общего синтеза клеточных белков характерна значительная депрессия во время шока и в первые часы после него. Синтез основных клеточных  белков начинает усиливаться через 7-8 ч и достигает нормальных значений только через 24 ч после окончания шока. В связи с этим, на определенном этапе после шока Hsp70 может составлять 15-20% от всех белков цитоплазмы.

Кроме того, после стресса Hsp70 может накапливаться в наиболее «уязвимых» участках клетки, а именно: в первые 4-5 ч – в ядре, затем в перинуклеарной, присарколеммальной зонах и вдоль актиновых  филаментов. Смысл накопления Hsp70 в ядре после повреждения клетки заключается в защите генетического материала. Таким образом, Hsp70 играет значительную роль в повышении устойчивости клеточного аппарата биосинтеза белка к повреждающим воздействиям. Кроме того, имеютс я данные о связи Hsp70 с вновь синтезированными тяжелыми цепями Ig в тех областях, где может происходить как нормальное связывание с легкой цепью, так и нежелательное связывание тяжелых цепей друг с другом, т.е. его присутствие препятствует образованию агрегатов из тяжелых цепей. Затем в ходе АТФ-азной реакции легкая цепь вытесняет белок теплового шока и формируется нормальная структура Ig. Накопление Hsp70 после кратковременных воздействий на клетку тепловым шоком лежит в основе феномена временного повышения порога температурной чувствительности клеток, так называемой термотолерантности.

Физиологическая роль Hsp70 изучалась на множестве моделей при таких условиях, как гипертермия, гипертензия, контакт с токсичными химическими веществами, гипоксия, ишемия, воспаление, аутоиммунные патологии, апоптоз, злокачественные опухоли, трансплантация органов, бактериальные и вирусные инфекции. Уровень Hsp70 также исследовали при нормальных процессах старения, сперматогенеза, в зависимости от фазы менструального цикла и физической нагрузки. Рядом исследователей отмечено, что при аутоиммунных заболеваниях, таких как СКВ, РА, повышение содержания Hsp70 в лимфоцитах крови связано с активностью патологического процесса. При повторяющихся эпизодах ишемии/реперфузии также была обнаружена активация синтеза Hsp70. Было показано, что кратковременные эпизоды окклюзий коронарных артерий с интервалами реперфузии существенно повышали толерантность миокарда к последующим, более длительным ее эпизодам, что приводило к снижению частоты развития инфаркта миокарда, снижению риска жизнеугрожающих аритмий. Белки теплового шока в этой ситуации выступают не только как шапероны, но и как потенциальные антиоксиданты. Таким образом, обнаруженная связь между содержанием Hsp70 в клетках и устойчивостью тканей к ишемии и реперфузии, участие Hsp70 в формировании термотолерантности и явления перекрестной толерантности к разным повреждающим агентам служат проявлением их ярко выраженных цитопротекторных свойств. Вместе с тем, Hsp необходимы для нормальной жизнедеятельности клетки, т.к. участвуют в поддержании клеточного гомеостаза, процессах роста и дифференцировки клеток.

Можно выделить следующие основные положения о физиологической роли Hsp70:

• В клетке после стресса быстрыми темпами происходит накопление Hsp70, предшествующее восстановлению синтеза других клеточных белков.

В ранний постстрессорный период Hsp70 локализуется в основном в ядре, в поздний – в 3 областях цитоплазмы: присарколеммальной, перинуклеарной и вдоль актиновых филаментов.

В клетке, подвергшейся стрессорному воздейс твию, Hsp70 мгновенно нормализуют формирование рибосом, предупреждая агрегационные процессы при фолдинге белков и восстанавливая нормальную структуру миофибриллярного аппарата.

В постстрессорный период Hsp70 является составной частью клеточной системы репарации, защищая процессы биосинтеза белка и структурную целостность клеточных пептидов.

 

Белок теплового шока – Hsp70B’

Hsp70B’ человека – это основный вариант Hsp70, являющийся продуктом отдельного гена, который лишен интронов. Последовательность гена Hsp70B’ на 77% идентична гену Hsp70 (идентичность по кДНК – 70%). В отличие от Hsp70, для которого показан базовый уровень экспрессии и индукция при нагревании и других воздействиях, Hsp70B’ строго индуцируется только нагревом и не экспрессируется конституционно. В одном из исследований было показано использование Hsp70B’ как гена-мишени для изучения однонуклеотидных позиций в геномной ДНК (SNP) в биоптатах человеческой опухоли предстательной железы. Однако использование белка Hsp70B’ при исследовании белков теплового шока только начинает развиваться.

 

Белок теплового шока Hsp90α

Семейство белков Hsp90 очень консервативно и выявляется у всех видов. В норме Hsp90 может составлять 12% от всех белков клетки, но этот уровень увеличивается при тепловом шоке или при воздействии других стрессфакторов на клетку. В условиях теплового шока высокий уровень Hsp90 необходим для эффективной реактивации денатурированных нагреванием белков, тогда как при нормальных условиях Hsp90 требуется отдельным группам субстратных протеинов. Hsp90 млекопитающих обычно существует в виде димеров и во многом функционально подобен Hsp70. Другие шапероны часто обнаруживаются в Hsp90-комплексах в цитоплазме и образуют интегральную часть повсеместной многокомпонентной системы шаперонов. Hsp90 участвует во многих пу тях передачи сигнала, включая рецепторы глюкокортикоидов и прогестерона, эстрогена, диоксина и протеинкиназ. Детальный анализ экспрессии подтверждает, что Hsp90α играет специфическую роль в нормальном процессе миогенеза, дополнительно защищая клетки эмбриона от неблагоприятных факторов окружающей среды. Различные профили экспрессии изоформ Hsp90 дополнительно подчеркивают их функциональную значимость во время онтогенеза и стресса у животных.

Новые исследования предприняты для изучения внеклеточной роли Hsp90α. Известно, что Hsp90α действует как шаперон матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) в клетках HT-1080 фибросаркомы, приводя к повышению инвазивности опухоли. В недавних клинических исследованиях Hsp90-комплекс шаперонов был использован как молекулярная мишень при раке пищевода человек а. Во многих исследованиях было показано, что шапероны облегчают злокачественную трансформацию на молек улярном уровне, и Hsp90 предложен в качестве новой мишени для противоопухолевой терапии. Для изучения роли Hsp90 в развитии детских опухолей был использован гелданамицин, ингибитор Hsp90. В преклинических исследованиях на моделях рак а молочной железы были использованы ингибиторы Hsp90 в комбинации с общепринятыми методами химиотерапии для подтверждения роли Hsp90 как онкогенной мишени при этом заболевании.