Анализ нарушений системы комплемента

Оглавление

1. Общий скрининг активации системы комплемента (3 пути: классический, альтернативный, лектиновый)

С1-ингибитор СК (функциональная активность)

Циркулирующие иммунные комплексы, содержащие C3d

Выявление ЦИК, по способности связываться с C1q

 

2. Лектиновый путь активации системы комплемента

Активность маннан-связывающего лектина, уровень MASP-2

 

3. Альтернативный путь активации комплемента

Фактор D (Адипсин)

Фактор Р (Пропердин)

Продукты активации системы комплемента

 

Сокращения раздела

АО – ангионевротический отек Квинке (НАО – наследственный, ПАО – приобретенный)

ИК – иммунные комплексы

IL – интерлейкин

IFN – интерферон

МАК – мембраноатакующий комплекс

М-КСФ – макрофагальный колониестимулирующий фактор

м.м. – молекулярная масса

РА – ревматоидный артрит

СК – система комплемента

СКВ – системная красная волчанка

TCC – терминальный комплекс

ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы

С – компонент комплемента (С1, С2 и т.д.)

Ig – иммуноглобулины

MBL – маннан-связывающий лектин

 

 

Система комплемента (СК) имеет ключевое значение при развитии многих аутоиммунных и инфекционных заболеваний. К функциям СК относят, в первую очередь, элиминацию чужеродных клеток, а также блокировку антигена и регуляторную функцию в иммунном ответе. Существуют 3 пути активации комплемента (рис. 1): классический, альтернативный и, относительно недавно отрытый, лектиновый.

 

Общий скрининг активации системы комплемента (3 пути: классический, альтернативный, лектиновый)

Классический путь активации – самый эффективный и наиболее специфичный, он включается только в том случае, если в крови присутствуют иммунные комплексы, содержащие иммуноглобулины (Ig) M, G1, G2 или G3. Свободные формы перечисленных Ig, а также иммунные комплексы с другими классами и подклассами Ig (E, D, G4, A1 и A2) не активируют классический путь. При активации классического пути СК дополняет и усиливает антигенблокирующее действие Ig. Фрагменты компонентов комплемента (такие как С3а, С4а, С5а), высвобождающиеся в плазму при активации СК, обладают хемотаксическим и анафилактическим действием, таким образом, они дополнительно активируют клеточное звено иммунной системы. Альтернативный и лектиновый пути активируются и в отсутствие специфических антител.

Для их активации достаточно определенной полисахаридной структуры, например, бактериальной клеточной стенки. Таким образом, альтернативный и лектиновый пути инициируют первичный иммунный ответ даже в той ситуации, когда антиген еще не распознан антителами или иммунокомпетентными клетками. Однако эти пути характеризуются довольно низкой специфичностью, и гиперактивация СК через эти пути может привести к развитию аутоиммунных поражений. При дефиците отдельных компонентов наблюдается ослабление активности СК в целом, что служит причиной склонности к повторяющимся или внезапным тяжелым инфекциям. Дефицит компонента С3 или фактора В приводит к повышению чувствительности организма к гнойным инфекциям. Недостаточность терминальных компонентов С5, С6, С7 и С8, а также компонентов альтернативного пути – фактора С1-ингибитор D и пропердина, создает особую предрасположенность к инфекциям, вызываемым двумя видами NeisseriaN. gonorrhoeae и N. meningitidis. Дефицит некоторых компонентов классического пути (C1q, C1r и C1s, C4 или C2) ассоциирован с предрасположенностью к заболеваниям, которые обусловлены нарушениями в формировании и клиренсе иммунных комплексов, например, с возникновением системной красной волчанки (СКВ). Причиной аутоиммунного повреждения тканей и хронического воспаления может также стать неспецифическая, спонтанная активация комплемента.

 

Схема основных событий трех путей активации СК

 

Особенность диагностики нарушений СК состоит в том, что сывороточный уровень отдельных компонентов часто плохо коррелирует с клиническим состоянием пациента. Это связано с тем, что количественное определение концентрации того или иного компонента не позволяет судить о его функциональной активности. Кроме того, полный анализ нарушений в активации СК должен включать определение более десяти компонентов. Поэтому долгое время для скрининга использовался только гемолитический метод, который, однако, имел множество недостатков: невысокая чувствительность, плохая воспроизводимость, невозможность стандартизации.

В наборе в лунках микропланшета сорбированы специфические активаторы классического, альтернативного или лектинового путей. Образцы сыворотки пациентов разводят одним из буферов, содержащих специфические блокаторы для обеспечения активации только одного пути. После инкубации разведенных образцов сыворотки и промывки лунок, образовавшийся [C5b-С9 n] (терминальный комплекс) выявляется специфическими антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Степень активации комплемента коррелирует с интенсивностью окрашивания и измеряется в значениях абсорбции.

 

С1-ингибитор СК (функциональная активность)

С1-ингибитор – является одним из важнейших блокаторов сериновых протеаз: С1r и C1s (субкомпонентов С1-эстеразы каскада СК), MASP-1 и MASP-2 (протеаз, активирующих лектиновый путь СК), а также плазмина, калликреина, фактора XIa, фактора XIIа. С1-ингибитор – полипептид с м.м. 76 кДа, состоящий из двух доменов, содержащих 113 остатков аминокислот в N-концевом домене и 365 – в C-концевом. Нормальная концентрация С1-ингибитора в плазме – 0,2 г/л.

С1-ингибитор является одним из классических белков острой фазы, синтез которого регулируется провоспалительными цитокинами. Так, показано положительное влияние интерферонов ИФН-α, -β и -γ на синтез С1-ингибитора моноцитами и фибробластами кожи человека. ИЛ-6 (основной гепатостимулирующий фактор), действуя на клетки линий HepG2, индуцирует синтез С1-ингибитора, одновременное добавление к клеткам ИФН-γ приводит к синергизму действия двух цитокинов. ИЛ-1, действуя совместно с ИЛ-6, вызывает уменьшение синтеза С1-ингибитора, а с ИФН-γ – напротив, повышает его продукцию. М-КСФ увеличивает синтез С1-ингибитора моноцитами человека.

 

С1-ингибитор имеет первостепенную диагностическую важность для дифференциации природы отека Квинке (аллергического и псевдоаллергического происхождения). Ангионевротический отек Квинке псевдоаллергической природы тяжелое аутоиммунное заболевание, развивающееся при сниженном уровне С1-ингибитора. Псевдоаллергический ангионевротический отек может быть как врожденным (наследственный ангионевротический отёк), так и приобретенным (ПАО).

 

НАО характеризуется следующими клиническими симптомами: несистемной красной волчанкой, гломерулонефритом, а также эпизодическими подкожными и слизистыми отеками. У пациентов с несистемным волчаночным гломерулонефритом прогноз неблагоприятный. Через 8-20 лет после постановки диагноза отмечается прогрессирующая хроническая почечная недостаточность. Другое проявление несистемной красной волчанки с мембранопролиферативным гломерулонефритом – развитие макроскопической гематурии, азотемии и васкулита.

 

В 15% случаев дефицита С1-ингибитора его концентрация остается в норме, а снижена только его функциональная активность. Поэтому функциональная активность С1-ингибитора (ингибирующая способность) – наиболее ёмкий диагностический показатель. Хромогенный метод, предлагаемый компанией БиоХимМак, позволяет определять активность С1-ингибитора по способности ингибировать С1-эстеразу.

 

Этиология ПАО связана, как правило, с появлением IgG аутоантител против С1-ингибитора. Аутоантитела другой специфичности играют, по-видимому, главную роль в приобретенной гемофилии и при гломерулонефрите. При дефиците С1-ингибитора патологическая активация СК, вызванная циркулирующими иммунными комплексами, криоглобулинами, парапротеинами, приводит к появлению крапивницы или ангиоэдемы. В настоящее время описаны случаи сочетанной СКВ и АО, СКВ-подобного состояния и гломерулонефрита. В литературе отмечают связь лимфопролиферативных процессов (лимфосептическая лейкемия, неходжкинская лимфома) с ПАО. Приобретенный дефицит С1-ингибитора может быть вызван инфекциями различной природы, например, парвовирусом. Helicobacter pylori также может приводить к дефициту С1-ингибитора и появлению симптомов ангионевротического отека. У больных с эхинококкозом, спустя 7 месяцев после оперативного вмешательства был обнаружен приобретенный дефицит С1-ингибитора.

Важно отличать этиологию несистемной и системной красной волчанки. При СКВ не обнаружено влияния аутоантител к С1-ингибитору на его функциональную активность in vitro. Было показано, что этиология дисфункции С1-ингибитора при СКВ отличается и от HAО, и от ПАО.

 

Циркулирующие иммунные комплексы, содержащие C3d

Иммунные комплексы антиген-антитело (ИК) образуются в организме постоянно. Формирование ИК представляет собой физиологический механизм защиты, приводящий к быстрой элиминации эндогенных или экзогенных агентов (например, микроорганизмы, вирусы, паразиты, растительные антигены, антигены грибов, пыльцы или пищевых продуктов) через ретикуло-эндотелиальную систему. В норме образовавшиеся ИК не должны циркулировать, они быстро элиминируются по механизму, в котором задействована СК и макрофаги. При нарушении механизма клиренса уровень ИК в циркуляции (ЦИК) повышается. Высокий уровень ЦИК в сыворотке и/или в других биологических жидкостях наблюдается при многих воспалительных и злокачественных заболеваниях. Клиренс ИК нарушается при дефицитах отдельных компонентов комплемента классического пути (C1q, C1r и C1s, C4 или C2). При недостатке компонентов комплемента ЦИК преципитируют и откладываются преимущественно на сосудистой стенке и на структурах, экспрессирующих Fc-рецепторы, например, на базальных мембранах (в том числе почечных). В результате развивается иммунокомплексная патология (реакция гиперчувствительности III типа). Преципитация ЦИК вызывает различные эффекты: активируется СК по классическому пути, вследствие чего выделяются анафилатоксины (C3a, C4a, C5a), активируются макрофаги, инициирующие развитие местного воспалительного процесса с привлечением тучных клеток и нейтрофилов.

ЦИК в повышенной концентрации выявляются у многих пациентов с СКВ и ревматоидным артритом (РА), особенно имеющих сосудистые осложнения. С преципитацией ЦИК связаны некоторые формы нефритов. Уровень ЦИК коррелирует с тяжестью перечисленных заболеваний.

Многие тесты для определения ЦИК основаны на преципитации полиэтиленгликоля, радиальной иммунодиффузии и на анализе функциональной активности клеточных линий (Raji). К сожалению, пока не существует ни одного метода, позволяющего определять все типы ЦИК.

 

Компания БиоХимМак предлагает тест-систему для определения ЦИК по фрагменту комплемента C3d. Набор выявляет ЦИК, содержащие IgG и фрагмент C3d, т.е. ЦИК, активирующие классический путь СК. Поэтому определяемые классы ЦИК обладают наибольшей активностью и достоверно отражают клиническую картину аутоиммунных патологий.

 

Выявление ЦИК, по способности связываться с C1q

С1q (субкомпонент С1 компонента СК) взаимодействует с ИК, содержащими антитела двух классов: IgG и IgM. Для начала активации С1 необходимы минимум две молекулы IgG или одна молекула IgM (6-валентна), у которой, по крайней мере, две валентности должны прореагировать с антигеном. С1q присоединяется к СН2 домену IgG, или к СН4 домену IgM. Со свободными формами Ig С1q связывается очень слабо. Так, константа связывания С1q со свободным IgG меньше на четыре порядка константы связывания с агрегированным IgG или IgG в составе ИК. На принципе взаимодействия С1q с Ig базируется метод определения ЦИК методом ИФА. На полистироловом планшете сорбирован C1q, который связывает большинство типов ЦИК.

 

Лектиновый путь активации системы комплемента

Активность маннан-связывающего лектина, уровень MASP-2

Маннан-связывающий лектин (MBL) образует комплекс со специфичными сериновыми протеазами (MASP-1, -2, -3), из которых только MASP-2 обладает ферментативной активностью в отношении компонентов С2 и С4. Активация лектинового пути СК происходит только при том условии, что MBL, образовав комплекс с сериновой протеазой MASP-2, связывается со структурой, содержащей маннан или N-ацетилглюкозоамин, например, с клеточной стенкой бактерий. Комплекс [MBL–MASP-2] запускает лектиновый путь активации CК подобно тому, как комплекс [С1q–(C1s-C1r) 2 ] активирует классический путь, а MASP-2 в составе комплекса выполняет функцию аналогичную протеазе C1s.

Лектиновый путь является антителонезависимым, что важно для формирования быстрого иммунного ответа в том случае, когда организм ещё не выработал антител против возбудителя. Нормальный уровень MBL находится в пределах от 10 до 5000 нг/мл. Среди европеоидов более 12% популяции имеют уровень MBL ниже 100 нг/мл. Уровень MBL ниже 100 нг/мл относят к одному из типов иммунодефицитов. Таким образом, около 10% предположительно здорового населения в действительности имеет дефицит MBL. Низкая активность MBL может приводить к различным клиническим проявлениям, таким как возвратные инфекционные заболевания, болезнь Крона. Пониженная активность MBL также ассоциирована с повышенным риском развития сепсиса, фиброза, аутоиммунных поражений (например, РА, СКВ) и привычного невынашивания беременности. При проведении диагностики необходимо учитывать, что в период инфекционного заболевания уровень MBL всегда повышается по сравнению с базовым. Важен уровень MBL и для прогноза в трансплантологии, при концентрации MBL ниже 100 нг/мл долгосрочный прогноз приживаемости почки и сердца значительно ухудшается. Напротив, относительно высокий уровень MBL (>1000 нг/мл) ассоциирован с риском сердечнососудистых заболеваний, инфаркта миокарда, особенно на фоне развития сахарного диабета.

MASP-2 расщепляет С2 и С4, образуя С3-конвертазу – С4b2a. По функциональной активности MASP-2 похожа на протеазу С1s. C1-ингибитор и α2-макроглобулин в физиологической концентрации полностью блокируют ферментативную активность комплекса [MBL–MASP-2]. В отсутствие ингибитора этот комплекс опсонизирует бактерии, резко ускоряя их гибель. Нормальный уровень MASP-2 в сыворотке составляет 170-1200 нг/мл. Пониженная концентрация MASP-2 говорит о высокой чувствительности к инфекционным заболеваниям. Кроме того, MASP-2 является прогностическим маркером развития злокачественной опухоли пищевода и прямой кишки, повышенный уровень этой протеазы – неблагоприятный фактор при онкологии.

В свою очередь активность наиболее эволюционно древней MASP-1 схожа с активностю тромбина, что позволяет предположить участие MASP-1 в защитных реакциях врождённого иммунитета, основанных на коагуляции. MASP-3, судя по литературным данным, не участвует в активации СК. Биологическая роль MASP-3 остается невыясненной, поскольку эта протеаза расщепляет лишь синтетический субстрат, а натуральный субстрат пока неизвестен.

 

«ЗАО БиоХимМак» предлагает три ИФА-набора для всесторонней оценки лектинового пути : 1. Оценка активности MBL по связыванию с маннаном 2.  Количество MASP-2 (тест-система, не имеющая аналогов в мире) 3.  Общая активность комплекса MBL–MASP-2 по способности расщеплять компонент C4 (тест-система, не имеющая аналогов в мире).

 

Уровень MBL обычно коррелирует со способностью депонировать C4b, однако, при одном и той же концентрации MBL величина депонирования может варьировать в 3 раза. Количество депонированного C4b – лучший количественный показатель активации лектинового пути, поскольку это одновременная оценка активностей MBL и MASP-2 при функционировании в комплексе.

 

Альтернативный путь активации комплемента

В активации альтернативного пути участвуют шесть белковых факторов: В, D, Р, H, I и компонент С3, общий для всех путей. Причем некоторые белки альтернативного пути активации являются функциональными аналогами белков классического пути. Фактор D действует аналогично C1s: если C1s активирует компонент С2, то фактор D подобным образом воздействует на В фактор. Фактор В в альтернативном пути активации при формировании С3-конвертазы и С5-конвертазы играет роль, аналогичную компоненту С2. Ключевая стадия альтернативного пути СК – формирование С3/С5-конвертазы альтернативного пути [C3b n Bb]. Дефицит любого белка альтернативного пути СК проявляется повышенной чувствительностью к инфекционным заболеваниям. Из дефицитов компонентов альтернативного пути описан дефицит фактора D у 3 пациентов с повторными инфекциями, вызванными нейссериями, а также дефицит пропердина более, чем у 70 пациентов. Около 45% пациентов с дефицитами пропердина перенесли менингококковую инфекцию, при этом летальность составила более 25%.

 

Фактор D (Адипсин)

Фактор D (Адипсин) – сериновая протеаза, необходимая для формирования С3/С5-конвертазы альтернативного пути. Фактор D очень специфичный фермент, его единственным естественным субстратом является фактор B. Причем для расщепления фактора B необходимо, чтобы он был связан с фрагментом C3b, тогда при участии фактора D происходит отщепление фрагмента Ва и формирование С3/С5-конвертазы [C3b n Bb]. Фактор D экспрессируется различными типами клеток: моноцитами, макрофагами, миоцитами, клетками эндометрия, почек, тонкого кишечника, а в особенности адипоцитами. Катаболизм фактора D непосредственно связан с функцией почек. В случае почечной недостаточности уровень циркулирующего фактора D значительно возрастает. Напротив, практически все случаи дефицитов фактора D являются врожденными, а не приобретенными. Вероятно, при ускоренном катаболизме факторов альтернативного пути прежде всего происходит истощение фактора B и компонента С3, а фактор D практически не расходуется при активации. Поскольку обычно дефициты фактора D являются наследуемыми, то имеет смысл проводить скрининг среди родственников пациента с этим дефицитом. Все случаи дефицита фактора D ассоциированы с низкой сопротивляемостью организма против патогенов бактериальной природы. Особое внимание требуется обратить на пациентов, подверженных частым заболеваниям менингитом. Пациенты с врожденным гомозиготным и гетерозиготным дефицитом фактора D характеризуются повышенной чувствительностью к менингиту. Исследования показывают плохую опсонизацию клеток N. meningitidis факторами альтернативного пути, изза чего не происходит нейтрофильный фагоцитоз патогенов. В этом случае искусственное введение препарата фактора D восстанавливает нормальную опсонизирующую функцию комплемента против патогена.

 

Фактор Р (Пропердин)

Фактор Р (Пропердин) играет стабилизирующую роль в сохранении активности С3/С5-конвертаз альтернативного пути, увеличивая период полураспада в 10 раз. Пропердин в крови существует в неактивной форме. Его активация происходит в результате контакта с C3bBb и, по-видимому, обусловлена конформационными изменениями молекулы. Активированный пропердин связывается с C3b или C3b-подобным белком в конвертазе и стабилизирует ее, тем самым, индуцируя активацию альтернативного пути, продлевая время существования конвертаз. Нормальная концентрация пропердина в сыворотке 20 мкг/мл, молекулярная масса – 220 кДа. Пропердин, как правило, используют как маркер повышенного риска заболевания менингококковой инфекцией.

 

Продукты активации системы комплемента (TCC, фрагменты С3а-desArg, С4аdesArg и С5а-desArg)

Заключительная фаза атаки мембраны начинается с расщепления компонента С5 на два фрагмента С5а и C5b. Этот процесс осуществляет С5-конвертаза (одного из путей активации), которая отщепляет фрагмент С5а от N-конца α-цепи молекулы С5. Образующийся фрагмент С5а обладает очень сильной анафилактической активностью, а также способностью осуществлять хемотаксис. В результате активации классического пути образуется всего три анафилатоксина (фрагменты С3а, С4а, С5а). Эти же анафилатоксины образуются и при активации СК по другим механизмам: при активации альтернативного пути – С3а, С5а, при активации лектинового пути – С4а, С5а. Фрагменты С3а и С4а несколько уступают по хемотаксическому и анафилактогенному действию фрагменту С5а. В отсутствие механизма регуляции действие анафилотоксинов может привести к анафилактическому шоку – чрезвычайно опасному состоянию с риском летального исхода. Быстрая инактивация анафилотоксинов С3а, С4а и С5а достигается удалением аргинина с карбоксильного конца этих пептидов с помощью специального сывороточного фермента – карбоксипептидазы В. При этом образуются формы С3а-desArg, С4а-desArg и С5а-desArg. Таким образом, фрагменты С3а-desArg, С4а-desArg и С5а-desArg являются маркерами анафилактической реакции, воспаления и риска отторжения трансплантата.

Все три пути активации СК ведут к сборке терминального (TCC) или мембраноатакующего (МАК) комплекса (корректнее рассматривать, что МАК – частный случай ТСС, когда сборка произошла именно на клеточной мембране). После расщепления компонента С5 на фрагменты С5а и C5b происходит быстрый неферментативный процесс образования С5b–С6–С7– С8–С9 n – цитолитического комплекса на клеточной мембране атакуемой клетки. Молекулы компонента С9 (от 12 до 21 молекул на комплекс) прошивают насквозь клеточную мембрану, формируя цилиндрический канал. Образующееся отверстие диаметром около 100 Е позволяет низкомолекулярным веществам свободно проходить внутрь клетки. Образовавшийся МАК действует настолько эффективно, что для лизиса прокариотической клетки может быть достаточно одного комплекса [C5b–С9 n ]. М.м. [C5bС9 n ] порядка 1700 кДа (550 кДа – масса C5b–8 и 1100 кДа – средняя масса поли-С9-структуры).

Сборка комплекса [C5b–С9 n] может происходить и в жидкой фазе при участии S-белка (витронектина) – фактора гомологичной рестрикции, который защищает клетки организма от аутоиммунной агрессии. А некоторые клетки (например, нейтрофилы человека) способны защищаться от лизиса путем локального выпячивания мембраны, которое затем полностью отделяется от клетки в виде везикулы, унося на себе МАК. Так или иначе, даже в здоровом организме растворимые формы TCC присутствуют, поскольку активация СК происходит постоянно. Но в случае инфекционного заболевания, воспалительного процесса мощность активации СК резко повышается, соответственно возрастает и уровень ТСС, который служит надежным маркером воспаления.